قدرة بعض العزالت الفطرية المحلية على إنتاج أنزيم السيللوالز ود ارسة الفعالية األنزيمية

Transcript

1 مجلة جامعة تشرين للبحوث والد ارسات العلمية _ سلسلة العلوم البيولوجية المجلد )73( العدد )2( 2102 Tishreen University Journal for Research and Scientific Studies - Biological Sciences Series Vol. (73) No. (2) 2102 قدرة بعض العزالت الفطرية المحلية على إنتاج أنزيم السيللوالز ود ارسة الفعالية األنزيمية الدكتورة نوال علي * الدكتورة سناء سارة ** )تاريخ اإليداع.2102 / 00 / 01 قبل للنشر في )2102 / 2 / 21 ملخ ص عزل من المحيط الجذري لنبات القمح. TriticumaestivumLاألنواع الفطرية اآلتية: Aspergillusniger,Fusariumsolani, harzianumtrichoderma, T.viride, T.longibrachiatum Rhizoctoniasolani, F.oxysporum وalternate.Alternaria تبيان جميع العزالت المدروسة قابلية إلنتاج أنزيم السيللوالز لإلنتاج بمعدل Cellulase في الوسط الصلب( CMC-Agar ) إذ أعطى الفطر. Tأعلى viride قابلية 5.16 بينما أعطى الفطر Rhizoctoniasolani أقل إنتاجية لألنزيم بمعدل وأظهرت الد ارسة الكمية باستخدام وسط مندل السائل أن أعلى إنتاجية للسيللوالز أعطاها الفطر T.viride األنزيميةU/mL 4.39 كما أعطى أكبر كتلة حيوية وقيمتها 8.96g/L بينما إذ بلغت الفعالية أعطى الفطر Rhizoctoniasolani أقل إنتاجية أنزيمية إذ بلغت الفعالية األنزيميةU/mL 2.04 وبلغت الكتلة الحيوية g/l وتبين من د ارسة تأثير مصادر كربونية مختلفة على الفطرT.harzianum الفعالية األنزيميةU/mL3.87 وبلغت الكتلة الحيوية g/l أن السكروز كان األفضل في إنتاجية السيللوالز إذ بلغت الكلمات المفتاحية: أنزيم السيللوالز فعالية السيللوالز Trichodermaviride * أستاذ - قسم علم النبات كلية العلوم جامعة تشرين الالذقية. ** مد رس - قسم علم الحياة الحيوانية جامعة تشرين الالذقية. 74

2 قدرة بعض العزالت الفطرية المحلية على إنتاج أنزيم السيللوالز ود ارسة الفعالية األنزيمية علي سارة مجلة جامعة تشرين للبحوث والد ارسات العلمية _ سلسلة العلوم البيولوجية المجلد )73( العدد )2( 2102 Tishreen University Journal for Research and Scientific Studies - Biological Sciences Series Vol. (73) No. (2) 2102 The ability of some local fungal isolates to produce Cellulase and the study of the enzymatic activity Dr. Nawal Ali * Dr. Sanaa Saraa ** (Received 19 / 11 / Accepted 20 / 4 / 2102 ) ABSTRACT The following Fungal species were isolated from therhizosphere of wheat plant (TriticumaestivumL.): Trichodermaharzianum, T. viride, T. longibrachiatum, Rhizoctoniasolani, Alternariaalternata, Fusariumsolani, Fusariumoxysporum and Aspergillusniger. It was shown that all isolated fungi had the capacity to produce cellulase in solid medium (CMC- Agar), while the fungus T.viride gave the highest capability for the production of this enzyme(5.16). The fungus Rhizoctoniasolani gave less productive ratio (2.61). Quantitative test using Mandelium liquid medium showed that the fungus T.viride had the highest productivity of Cellulase(4.39 U/mL), and this fungus had greater biomass (8.96 g/l). The fungus Rhizoctoniasolani gave lower enzyme productivity(2.04 U/mL) and its biomass reached(4.65 g/l). The study of different carbon sources for the fungus T.harzianum showed that Sucrose was the best media in Cellulase productivity. It reached (3.87U/mL), and the biomass was (2.83 g/l). Key Words: Sellulase, Activity Sellulase, Trichodermaviride. * Professor, Department of Botany, Faculty of Science Tishreen University, Lattakia, Syria. ** Assistant Professor, Department of Zoology, Faculty of Science Tishreen University, Lattakia, Syria. 74

3 Tishreen University Journal. Bio. Sciences Series مجلة جامعة تشرين العلوم البيولوجية المجلد )73( العدد )2( 2102 مقدمة: السيللوز يتكو ن غليكوزيدية من نموذج Cellulose من عدة آالف من جزيئات السكر البسيط D 4) β(1 ويعدالسيللوز غلوكوبي ارنوز المرتبطة بروابط مقاوما نسبيا للتحلل المائي وأغلب المحالت العضوية وهذا يدل على صعوبة الحصول على سكر الغلوكوز من السيللوز إال بوجود األنزيم القادر على تحلله[ 1 ] فاإلنسان ومعظم الثدييات ال تستطيع هضم السيللوز نظ ار لغياب األنزيم القادر على تحلله بينما المجت ارت تستطيع ذلك بوساطة األحياء الدقيقة الموجودة في الكرش واألمعاء. والسيللوز أحد المركبات العضوية األكثر وفرة في الطبيعة ويكو ن حوالي (15-60)% الضوئي حوالي الدور المهم من مكونات الجدار الخلوي للنباتات فيكسبها الشكل والقساوة [2] وتنتج النباتات سنويا بعملية التركيب طن من السيللوز[ 3 ] يت اركم بعضها دون استخدام للكائنات الدقيقة كالفطريات والبكتيريا مسببا مشاكل بيئية كثيرة [4]. وهنا برز التي درست من قبل العديد من الباحثين [5] كأحد الحلول لتفكيك السيللوز وتحويله إلى سكريات بسيطة يسهل استخدامها في العديد من التخم ارت الصناعية إلنتاج مواد ذات قيمة اقتصادية عالية [6] وتعود قدرة الكائنات الدقيقة على تحليل مادة السيللوز بسبب إنتاجها ألنزيم السيللوالزCellulase الذي يفكك الروابط الغليكوزيدية بين جزيئات الغلوكوز ويحوله إلى سكر غليكوز بسيط الذي يعد عنصر طاقة مهما للخاليا ا ومصدر أساسيا لألكسدة و هو سهل التمثيل من قبل مختلف الكائنات الدقيقة المستخدمة في الصناعات الكيميائية والطبية والغذائية كإنتاج الكحول والحموض العضوية والمضادات الحيوية وانتاج األغذية الحيوانية [7]. يضاف أنزيم السيللوالز إلى عليقة الماشية كمادة مساعدة على الهضم كما يستخدم في الصناعات النسيجية والورقية والهندسة الو ارثية[ 8 ]. يعد أنزيم السيللوالز معقدا أنزيميا متكامال مكو نا من ثالث أنزيمات تسهم مجتمعة في حلمهة السيللوز على نحو كامل عن طريق تحطيم الروابط الغليكوزيدية( 4 1)β واألنزيمات هي: 1. Endo- 1,4- β-d- glucanase (Mcase, EC ). 2. Exo 1,4- β-d glucanase (Cellobiohydrolase, EC ). 3.β-Glcosidase ( Cellobiase, EC ). [9] يعد نمو الفطور والبكتيريا المنتجة ألنزيم السيللوالز على المخلفات الصناعية والز ارعية وتحويلها إلى مواد ذات فائدة حيوية من أهم الحلول للتخلص من التلو ث البيئي السيللوزي[ 10 ]. إضافة إلى ذلك فإن تحويل السيللوز إلى سكريات بسيطة بطريقة الحلمهة األنزيمية باستخدام أنزيمات السيللوالز المنتجة من األحياء الدقيقة من المقترحات المهمة إلنتاج الوقود البديل )االيتانول([ 11 ] ونظ ار لألهمية االقتصادية ألنزيم السيللوالز التي تنتجه الكائنات الدقيقة مثل الفطريات التابعة لألجناس[ Cladosporium[12 Trichoderma,Aspergillus توجهت, األنظار لتنميتها واستخدامها في مجاالت عدة. أهمية البحث وأهدافه: تنبع أهمية البحث من أنه يسلط الضوء على دور بعض الفطور في إنتاج أنزيم السيللوالز أما الهدف فهو الحصول على عزالت محلية من فطور تملك قابلية عالية إلنتاج أنزيم السيللوالز فضال عن د ارسة تأثير بعض المصادر الكربونية في إنتاج أنزيم السيللوالزمن الفطر.T.harzianum 74

4 قدرة بعض العزالت الفطرية المحلية على إنتاج أنزيم السيللوالز ود ارسة الفعالية األنزيمية علي سارة ط ارئق البحث ومواده: 0( الحصول على العزالت الفطرية: استخدمت ثماني عزالت محلية مختلفة وهي: TrichodermaharzianumT.viride,T.longibrachiatum Alternaria alternate, Fusariumsolani Aspergillusniger,Rhizoctoniasolani, وFusariumoxysporum.عزلت جميع العينات من المحيط الجذري لنبات القمح. TriticumaestivumLعلى عمق (10- cm 5( باستخدام أطباق اآلغار على مستنبت Agar)( PDA Potato-Dextrose بأخذ 0.5g من عينة التربة إذ تجفف وتطحن ثم تنثر فوق طبق بتري يحتوي على مستنبت PDA والحاوي على الصاد الحيوي أمبيسيلين لتفادي نمو البكتيريا. حضنت األطباق عند درجة ح اررة 25±2 C لمدة أسبوع ومع الفحص يوميا بدءا من اليوم الثالث. تم تحديد األنواع لكل من العزالت المدروسة بفحص المستعم ارت النامية بوساطة المجهر الضوئي باالعتماد على شكل المستعمرة ولونها والفحص المجهري لتفرعات المشيجة الحوامل الكونيدية وشكل األبواغ وتم ت مقارنة هذه الصفات مع الم ارجع التصنيفية [15,14,13]. حفظت عينة نقية من األنواع المدروسة ضمن أنابيب اختبار على نحو مائل في الب ارد عند درجة ح اررة 4 C وتم تجديد العينات كل أسبوعين للمحافظة على حيوية الفطور وفعاليتها. 2( أوساط االستنبات: الوسط الصلب: أجري اختبار نوعي باستخدام الوسط الصلب الخاص بالكشف عن قابلية الفطور التي تم الحصول عليها إلنتاج أنزيم السيللوالز إذ استخدم وسط الكاربوكسيمتيل سيللوز آغار (CMC- Carboxymethyl Cellulose Agar Agar) الذي يتكون من المواد اآلتية )غ/ لترمن الماء المقطر( [16]: 10.0 CMC Na Salt 0.5 MgSO4.7H2O 20.0 Agar 1.0 K2HPO4 2.0 NaNO FeSO4 0.5 KCl حضر الوسط بإذابة جميع المواد في الماء المقطر باستثناءSalt CMC-Na )أضيف تدريجيا باستخدام خالط مغناطيسي مع التسخين حتى يتجانس الوسط( وضبط األس الهيدروجيني عند الدرجة 6.0 باستخدام حمض كلور الماء وماءات الصوديوم وعقم الوسط بجهاز األوتوكالف Autoclave عند الدرجة 121 C لمدة 15 دقيقة. وزع الوسط في أطباق بتري معقمة وتركت حتى يتصلب الوسط فيها ثم أضيف لكل طبق قرص من المستعمرة الفطرية المدروسة بقطر 5mm وبعمر أسبوع وحضنت األطباق عند الدرجة 28±2 C وتم م ارقبتها يوميا حتى اليوم الخامس. تم االستدالل على إنتاج األنزيم بمالحظة ظهور هالة فاتحة اللون حول المستعمرة الفطرية النامية في وسط الكشف عن أنزيم السيللوالز)شكل 1( التي أمكن مالحظتها بعد فت ارت مختلفة من الحضن والتي ازداد قطرها باستم ارر فترة الحضن داللة على زيادة قدرة الفطر على إنتاج أنزيم السيللوالز باستم ارر النمو. 21

5 Tishreen University Journal. Bio. Sciences Series مجلة جامعة تشرين العلوم البيولوجية المجلد )73( العدد )2( 2102 شكل : ( 1 )الكشف عن انتاج أنزيم السيللوالز بواسطة عزلة فطرية في الوسط الصلب a- قطر مستعمرة الفطر. b- قطر هالة التحلل. يدل ظهور الهالة على تحلل الCMCبوساطة إنزيم السيللوالز المفرز إلى الوسط الصلب. سحبت األطباق من الحاضنة بعد خمسة أيام من الحضن وقيس قطر المستعمرة الفطرية النامية وقطر الهالة المتكو نة حساب قابلية العزالت الفطرية على إنتاج أنزيم السيللوالز باستخدام المعادلة اآلتية[ 16 ]: قابلية الفطر على إنتاج أنزيم السيللوالز = قطر هالة التحلل/ قطر المستعمرة الفطرية وتم لكل منها. الوسط السائل: استخدم وسط مندل الزرعي الخاص باإلنتاج والذي يتكون من المواد اآلتية)غ/لتر من الماء المقطر([ 17 ]: 0.3 MgSO4.7 H2O FeSO4.7 H2O ZnSO4. H2O 10.0 Cellulose 1.0 Pepton 1.4 (NH4)2 SO4 2.0 KH2PO CoCl2 0.3 CaCl2 0.3 Urea تم إذابة جميع مكونات الوسط في الماء المقطر المعقم باستثناء اليورياUrea وضبط األس الهيدروجيني عند الدرجة 6.0 وزع الوسط المحض ر في دوارق مخروطية حجم 250 بواقع ml 50 ml في كل دورق سدت الدوارق بإحكام بسدادات قطنية ثم غلفت بأو ارق األلمنيوم وعقمت تحت نفس الظروف السابقة الذكر. وبعد إتمام عملية التعقيم أضيف Urea المعقم بالبسترة إلى الدوارق تحت ظروف معقمة. لقحت الدوارق بقرص من مستعمرة الفطر بقطر 5mm وبعمر أسبوع[ 18 ]. حضنت الدوارق بعد التلقيح في الحاضنة اله اززة عند الدرجة 28±2 C بمعدل 150 دورة / دقيقة ثم سحبت الدوارق من الحاضنة بعد 7 أيام من الحضن وقيس األس الهيدروجيني النهائي لكل دورق ثم أجريت عملية الترشيح لمحتوى كل دورق من الوسط الغذائي باستخدام أو ارق ترشيح من نوع (1 No. )Whatman مجففة وموزونة مسبقا ومثبتة على قمع بوخنرBauchnerFunelمجهز بمفرغ هوائي كهربائي وبعد انتهاء عملية الترشيح جففت أو ارق الترشيح الحاملة للكتلة الحيوية في فرن كهربائي عند الدرجة 70 Cلمدة 24 ساعة ومن ثم تم قياس الكتلة الحيوية بحساب فارق الوزنين باستخدام مي ازن حساس. ترك ال ارشح جانيا لقياس الفعالية األنزيمية للفطر وفي حال عدم 20

6 قدرة بعض العزالت الفطرية المحلية على إنتاج أنزيم السيللوالز ود ارسة الفعالية األنزيمية علي سارة استخدامه مباشرة أضيف لل ارشح بنزوات الصوديوم g/l) 1 )إليقاف نمو الفطور ثم حفظ في الثالجة عند درجة ح اررة 4 C لحين االستخدام [19]. قيست فعالية السيللوالز اعتمادا على قياس أحد نواتج التفاعل وهو سكر الغلوكوز D glucose المتحرر من ورقة الترشيح حسب طريقة Assay[17].Filter Paper تم قياس فعالية هذا األنزيم بأخذ 0.5 ml من الرشاحة في أنبوب اختيار حجم 18mL وأضيف إليها 1 ml من المحلول المنظم Na- Citrate Buffer ذي األس الهيدروجيني 4.8 وغمر بالمزيج أشرطة ورق ترشيح (1 No. Whatman )قياسcm 1x6 ووزنmg 50. حضنت األنابيب لمدة ساعة واحدة عند درجة ح اررة 50 C بعدها أضيف لكل أنبوب اختيار ml3 من كاشف DinitroSalicylicacid (DNSA) المحضر بطريقة.Miller[20] وضعت األنابيب في حمام مائي بدرجة الغليان لمدة 5 دقائق إليقاف التفاعل ومن ثم بردت إلى درجة ح اررة المختبر. بعدها تم قياس كمية الغلوكوز المتحرر باستخدام جهاز المطياف الضوئي Spectrophotometer من نوع )( UV-1700 عند طول موجةnm 550. حض ر الشاهد Blank مع التجربة بدون ورقة ترشيح وذلك للمقارنة. استخدم المنحني القياسي للغلوكوز النقي )المحض ر بنفس الطريقة السابقة الذكر(. ولرسم المنحني القياسي للغلوكوز تم تحضير محلول سكري بالت اركيز اآلتية: 0.01,0.02,0.03,0.04,0.05.أخذ mg/l 1mLمن كل تركيز وأضيف إليه 3 ml من كاشف DNSA بعد ذلك سخنت المحاليل لدرجة الغليان لمدة 10 دقائق ثم بردت إلى درجة ح اررة المختبر وسجلت االمتصاصية لكل تركيز على انف ارد عند طول الموجة. 550 nm تم تحديد فعالية أنزيم السليوالز بالوحدة األنزيمية Unit ويرمز لها بالحرف U وهي كمية األنزيم التي تحرر 1 ميكرومول من سكر الغلوكوز البسيط خالل دقيقة واحد وتحت ظروف طريقة العمل. نفذ البحث في مخابر كلية العلوم ومعهد البيئة / جامعة تشرين في الفترة الواقعة بين 2014/1/15 و 2014/7/15. النتائج والمناقشة: عزل من المحيط الجذري لنبات القمح الفطور اآلتية: TrichodermaharzianumT.viride, Alternaria alternate,fusariumsolani Aspergillusniger, Rhizoctoniasolani, T.longibrachiatum وFusariumoxysporum. وتم تعريفها اعتمادا على الم ارجع التصنيفية [15,14,13]. استخدمت طريقة األوساط الصلبة لتحديد قدرة الفطور المدروسة في إنتاج أنزيم السيللوالز إذ استخدم الوسط الزرعي الصلب الحاوي على الكربوكسيميتيل سيللوز )CMC-Agar) ويعد ظهور هالة فاتحة اللون حول المستعمرة الفطرية دليال على تحلل هذه المادة بوساطة أنزيم السيللوالز المنتج من قبل هذه الفطور وذلك نتيجة حلمهة السيللوز إلى سكريات بسيطة. أما قابلية العزالت الفطرية على إنتاج أنزيم السيللوالز فقد تم حسابها من العالقة )قابلية الفطر على إنتاج أنزيم السيللوالز = قطر هالة التحلل/ قطر المستعمرة الفطرية(. أظهرت النتائج أن جميع الفطور أعطت نتائج إيجابية لكنها متفاوتة بقدرتها على إنتاج أنزيم السيللوالز )جدول 1(. وقد أعطى فطرT.viride أعلى كفاءة في تحطيم مادة الكاربوكسيمتيل سيللوز إذ لوحظ ظهور هالة التحلل حول المستعمرة الفطرية بدءا من اليوم الثاني من الحضن و استمر ازدياد قطر الهالة باستم ارر فترة الحضن 22

7 Tishreen University Journal. Bio. Sciences Series مجلة جامعة تشرين العلوم البيولوجية المجلد )73( العدد )2( 2102 حتى اليوم الخامس حيث بلغ قطرهاcm 6.2.تبين هذه النتيجة أن T.virideيملك قابلية عالية إلنتاج أنزيم السيللوالز التي بلغت قيمتها 5.16 و أظهرت بقية الفطريات قد ارت متفاوتة بين الجيدة والمتوسطة والضعيفة إذ أعطى كل جدول )1(: قدرة الفطور المختلفة على انتاج أنزيم السيللوالز باستخدام الوسط الصلب( Agar (CMC- بدء ظهور هالة نوع الفطر التحلل اليوم الثاني T.viride اليوم الثاني F.solani اليوم الثاني A.niger اليوم الثالث.T harzianum اليوم الثالث.T longibrachiatum اليوم الثالث Alt.alternata اليوم الثاني.F oxysporum اليوم الثالث R.solani قابلية الفطر على إنتاج أنزيم السيللوالز قطر هالة التحلل بعد خمسة أيام/ cm / قطر المستعمرة الفطرية بعد خمس أيام/ cm / من الفطرين F.solani وA.nigerقابلية جيدة إلنتاج األنزيم أعطت الفطور, alternate longibrachiatum T.T. harzianum,alt. قيمتها 3.38, 3.18, 3.24 على التوالي. أما على إنتاج األنزيم ضعيفة وبلغت قيمتها 2.76 و 2.61 على التوالي. التي بلغت الفطرين R.solani, F.oxysporum فقد 4.00 و 3.83 على التوالي. بينما كفاءة متوسطة في إنتاج األنزيم و بلغت كانت قابلية كل منهما نستنتج مما سبق أنه يوجد تناسب طردي بين قطر هالة التحلل وكفاءة الفطور في إنتاج األنزيم وكلما ازدادت قدرة الفطر على إنتاج األنزيم ازداد قطر هالة التحلل باستثناء كل من الفطرينF.oxysporum.R.solani, لقد استخدمت طريقة األوساط الصلبة في إنتاج األنزيمات المحللة ( ألفا- بيتا أميالز سيللوالز بكتنازوالليباز( تم من قبل البكتيريا والفطور والخمائر لتحليل مخلفات المصانع من قشر ولب البرتقال من قبل [21]. إن النتائج التي الحصول عليها مطابقة لما تو صل إليه [22] عندما عزل 61 نوعا من الفطور من مناطق جذرية لعدد من النباتات إذ تبين أن الفطور المعزولة من مصادر مختلفة تنتج أنزيم السيللوالز بكميات مختلفة. كما كانت مطابق لما ذكره [23] الذي أشار إلى أن فطرreesei.T من أفضل الفطور المنتجة ألنزيم السيللوالز عند استخدام طريقة األوساط الصلبة. كما أكد [24] أن الفطور التابعة لجنس Trichodermaهي منأكثر الفطور إنتاجا ألنزيم السيللوالز. أظهرت نتائج د ارسة الفعالية األنزيمية لألنواع الفطرية المختلفة باستخدام الوسط السائل وجود تباين في قدرة هذه الفطور على إنتاج أنزيم السيللوالز)جدول 2 (.إذ أعطى الفطر. T virideأعلى فعالية ألنزيم السيللوالز بعد مرور 7 أيام من الحضن التي بلغت 4.39 U/mL وهذا يدل على أن هذا الفطر هو األعلى إنتاجية للسيللوالز. 25

8 قدرة بعض العزالت الفطرية المحلية على إنتاج أنزيم السيللوالز ود ارسة الفعالية األنزيمية علي سارة جدول) 2 (: قدرة العزالت الفطرية على انتاج أنزيم السيللوالز باستخدام وسط منداللسائل العزلة الفطرية الكتلة الحيوية فعالية أنزيم السيللوالز األس الهيدروجيني )U/mL( النهائي (g/l) (0.020) 5.73 (0,061) (0.090) T.viride (0.014) 6.28 (0.004) 3.94 (0,001) 8.16 Fusariumsolani (0.050) 6.24 (0.008) 3.52 (0.032) 6.98 Aspergillusniger (0.011) 5.27 (0.014) 3.17 (0.021) 5.72 T. harzianum (0.004) 5.40 (0.001) 3.72 (0.002)7.39 T. longibrachiatum (0.019) 5.56 (0.005) 3.14 (0.056) 6.23 Alternariaalternata (0.100) 4.90 (0.011) 2.58 (0.003) 4.92 F. oxysporum (0.080) 5.13 (0.007) 2.04 (0.016) 4.65 Rhizoctoniasolani كل قيمة هي معدل لثالث مكر ارت. أما األرقام بين قوسين فتمثل االنح ارف المعياري )S.D( بينما أعطى كل من:, F.solaniT.lonqibrachiatnm,A.niger,T.harzianumوA.alternata فعالية أنزيمية جيدة بلغت قيمها على التوالي 3.94( )3.14, 3.17, 3.52, 3.72, U/mL أما كل من وR.solani فكانا األقل إنتاجية ألنزيم السيللوالز وبلغت الفعالية األنزيمية لكل الفطرين. oxysporumf منهما) 2.04,2.58 ( U/mL على التوالي.وقد تطابقت النتائج التي تم الحصول عليها في الوسط السائل مع نتائج الوسط الصلب باستثناء فطرT.lonqibrachiatum إذ تفوق على كل من A.niger وharzianum. Tفي إنتاج األنزيم على خالف الوسط الصلب وربما يعود السبب لمالئمة الوسط السائل لهذا األنزيم أكثر من الوسط الصلب. فقد جاءت النتائج مطابقة لما توص ل إليه [ 25 ]الذي أك د أن جنس Trichoderma يعد قياسيا إلنتاج السيللوالز إذ أعطت عزلة فطر T.virideأعلى فعالية ألنزيم السيللوالز التي بلغت U/mL يمكن تفسير ضعف قدرة بعض العزالت على إف ارز أنزيم السيللوالز لعدة أسباب: إما أن تكون فترة الحضن غير كافية لتحفيز الفطور على إنتاج األنزيم أو بسبب االختالف في قدرة الفطور على استغالل وسط االستنبات أو عدم مالءمة ph الوسط لهذه الفطور وهذا ما أكده [ 27,26 ] إضافة إلى أن فعالية أنزيم السيللوالز المنتج من قبل الفطور تتباين باختالف السالالت المختلفة [29,28]. أما بالنسبة إلنتاج الكتلة الحيوية فيالحظ من الجدول( 2 )أن أقصى إنتاجية للكتلة الحيوية قد بلغت 8.96 g/l لفطر. T viride وهي العزلة التي أعطت أعلى فعالية ألنزيم السيللوالز. أما أقل إنتاجية للكتلة الحيوية فبلغت 4.65 g/l لفطرR.solani الذي أعطى أقل فعالية إلنتاج أنزيم السيللوالز وهذا يتطابق مع ما توص ل إليه[ 25 ] إذ إن أقصى إنتاجية للكتلة الحيوية حصل عليها كانت لفطر T.virideوبلغت g/l أما بالنسبة لألس الهيدروجيني النهائي فقد انخفض عند معظم الفطور عن األس الهيدروجيني األولي( 6.0 ( وF.solani التي ارتفع عندهما األس الهيدروجيني النهائي عن األولي قليال ووصل إلى باستثناء A.niger على التوالي وهذا يتوافق مع ما توص ل إليه [25]. إن سبب انخفاض األس الهيدروجيني النهائي )6.28, 6.24 ( يعود إلى طرح بعض الحموض العضوية في وسط النمو نتيجة نمو الفطور ونشاطها في إنتاج أنزيم السيللوالز. بينما ارتفاع األس الهيدروجيني يعود إلى تحرير شوارد الهيدروكسيلOH نتيجة العمليات االستقالبية. 27

9 Tishreen University Journal. Bio. Sciences Series مجلة جامعة تشرين العلوم البيولوجية المجلد )73( العدد )2( 2102 تأثير مصادر كربونية مختلفة على إنتاج السيللوالز بوساطة T.harzianum بعد 7 أيام من الحضن: اختيرت سبعة أنواع مختلفة من السكريات كمصادر كربونية أضيفت إلى الوسط الغذائي بنسبة 10 g/l لتنمية فطرT.harzianum ) تم اختيار هذا الفطر لكونه أحد أنواعTrichoderma التي تعد من أكثر الفطور إنتاجا للسيللوالز(. يالحظ من نتائج الجدول( 3 ) تباينا واضحا في إنتاج أنزيم السيللوالز باختالف المصدر الكربوني المضاف إلى الوسط الغذائي.إذ أعطى المصدر الكربوني سكروز أعلى فعالية أنزيمية بلغت 3.87 U/mL يليه جدول (3): تأثير مصادر كربونية مختلفة على إنتاج أنزيم السيللوالز لفطر T.harzianumبعد سبعة أيام من الحضن المصدر الكربوني سكروز الكتلة الحيوية( g/l ) فعالية أنزيم السلليوالز )U/mL ) (0.044) 3.87 (0.097) 2.83 األس الهيدروجيني النهائي (0.002) 5.4 (0.012) 5.7 (0.012) 3.28 (0.045) 1.64 CMC سليوبايوز فركتوز الكتوز نشاء غلوكوز (0.004) 5.2 ( 0.011) 4.9 ( 0.002) 5.3 ( 0.005) 4.8 ( 0.016) 4.5 (0.011) 3.01 ( 0.002) 2.98 ( 0.007) 2.46 (0.016) 2.39 ( 0.001) 1.92 (0.008) 2.36 (0.012) 2.67 (0.021) 1.20 (0.009) 3.00 (0.018) 2.29 كل قيمة هي معدل لثالث مكر ارت. أما األرقام بين قوسين فتمثل االنح ارف المعياري )S.D( المصدر الكربونيCMCالذي أعطى فعالية أنزيمية بلغت U/ml3.28 ومن ثم السليوبايوز الذي أعطى فعاليةU/mL3.01. بينما أعطت المصادر الكربونية فركتوز الكتوز نشاء وغلوكوز فعالية أنزيمية أقل بلغت,1.92) (2.98 U/mL, 2.39 على,2.46 التوالي.وهذا يتوافق مع ما توصل إليه [30] إذ أعطى المصدر الكربوني سكروز أعلى إنتاجية من أنزيم البيتا كلوكوسايديس بوساطة الفطر. T وتقارب harzianum ما حصل عليه استخدم السليوبايوز كمصدر كربوني إذ بلغت فعالية السيللوالز عنده توص ل إليها [31] عند د عندما [19] 2.48.بينما U/mL اختلفت عن النتائج التي ارسة تأثير عدة مصادر كربونية على إنتاج أنزيم السيللوالز باستخدام عزلة الفطر A.nigerإذ أعطى المصدر الكربوني كاربوكسيمتيل سيللوز أعلى فعالية إلنتاج السيللوالز. نالحظ من خالل النتائج على الرغم من أن CMC من السكريات المتعددة المحفزة إلنتاج أنزيم السيللوالز إال أن ه لم يكن المصدر الكربوني األمثل إلنتاج األنزيم ويعود ذلك إلى أن ذوبان هذا السكر في الوسط الغذائي يؤدي إلى زيادة لزوجته التي تؤثر سلبا على تهوية الوسط الغذائي وبالتالي صعوبة استغالل مغذيات الوسط من قبل الفطر. أما لتأثير المصادر الكربونية على إنتاج الكتلة الحيوية للفطر فقد أوضحت نتائج الجدول( 3 )أن إنتاجية الكتلة الحيوية للمصدر الكربوني النشاء كانت األعلى إذ بلغت الفركتوز السليوبايوز الغلوكوز وCMCالتي أعطت كتلة حيوية بلغت 3 يليه g/l السكروز بإنتاجية بلغت 2.83 g/l ثم سكر )2.67) 1,64, 2.29, 2.36, g/lعلى التوالي وأقل كتلة حيوية كانت لسكر الالكتوزو قيمتهاg/L1.20.وهذا يتعارض مع ما توص ل إليه[ 30 ] عندما أضاف النشاء كمصدر كربوني إلى الوسط الزرعي لفطر T.harzianum حيث أعطى كتلة حيوية 22

10 قدرة بعض العزالت الفطرية المحلية على إنتاج أنزيم السيللوالز ود ارسة الفعالية األنزيمية علي سارة بلغت نالحظ g/l من خالل نتائج الكتلة الحيوية أنه ال يوجد عالقة بين الكتلة الحيوية والفعالية األنزيمية عند إضافة مصادر كربونية مختلفة إلى الوسط الزرعي لفطر.T. harzianum أما بالنسبة لألس الهيدروجيني النهائي فيوض ح الجدول (3) انخفاضا له عن األس الهيدروجيني األولي (6.0) في جميع المصادر الكربونية المدروسة ويعود السبب ألن هذه المصادر تعمل على تحفيز الفطر إلنتاج حموض عضوية في أثناء عملياته االستقالبية التي تؤدي إلى رفع حموضة الوسط الغذائي. االستنتاجات والتوصيات: TrichodermaharzianumT.viride, T.longibrachiatum عزل ثمانية أنواع فطرية وتعريفها وهي: a. Alternaria alternate, Fusariumsolani Aspergillusniger, Rhizoctoniasolani, وFusariumoxysporum. b. كشف قابلية هذه األنواع.c الوسط الصلبAgar CMC- بلغت قيمتها إلنتاج أنزيم السيللوالز وتبين أن فطر.T viride أعطى أعلى إنتاجية على حددت الفعالية األنزيمية لألنواع الفطرية وتبين أن فطر.T viride أعطى أعلى فعالية أنزيمية على وسط مندل الزرعي بلغت U/mL.d استخدمت مصادر كربونية مختلفة وطبقت على عزلة واحدة تعود إلى النوع. Tوأعطى harzianum المصدر الكربوني سكروز أعلى فعالية ألنزيم السيللوالز وبلغت U/mL اعتمادا على نتائج البحث نوصي أن تكون الد ارسات القادمة مكملة له وتتعلق بد ارسة الشروط المثلى لعمل أنزيم السيللوالز المنتج من قبل الفطور ود ارسة اإلنتاج الحيوي للسيللوالز من خالل تنمية الفطور على المخلفات الصناعية السيللوزية. إضافة إلى د ارسة قدرة الفطور على إنتاج أنزيمات أخرى كاألميالز الكاتيناز والليباز.... الم ارجع: 1.Eveleigh, D.E.1987,Cellulase: aperspective. Philosophicl Transanctions of the Royal Society of London, Seris B-Biological Sciences.321: Mahmood, k., Wei-jun, Y.;Nazir, K.; Iqbal,R.Z. and Arijo,A. G.2006,Study of cellulolytic soil fungi and two nova species and new medium. J. Zhejiang Univ Science B, 7 (6), Chlesinger, S.1991, (Biogeo chemistry: an analysis of globalchange). Academic,San Diego,p Omojasola, P. F.; jilani, O.P. and Ibiyemi, S.A., 2008,Cellulase production by some fungi cultured on pineapple wastes. Nature and Science. 6(2).Issn: Wen, Z.; Liao,W. and Chen, S.2005,Production of Cellulase/ β- glugosidase by the mixed culture Trichodermareesei and Aspergillusphoenicis on daiary manure process Biochemistry.40: Ariffin, H.; Abdullah,N.;Umikalsom,M.S.;Shirai, Y. and Hassan,M.A.2006,Production and characterization of cellulose bybacillus pumilus EB3. Engineering & Technology.3 (1): داللي باسل كامل موضوعات مختارة في التكنولوجيا الحيوية. دار الكتب للطباعة والنشر. مطبعة جامعة الموصل.الع ارق. 25

11 Tishreen University Journal. Bio. Sciences Series مجلة جامعة تشرين العلوم البيولوجية المجلد )73( العدد )2( Beguin,P. and Aubert,J.P.1994,The biological degradation of cellulose FEMS Microbiol. Rev.13: Bhat. m. k.2000,cellulose and related enzymes in biotechnology. Biotech. Adv. 18: Tzanov, T.; Andreaus, J.; Guebitz, G. and Paulo, A.2003,Electronic J. Biotech. 6,3 11. Karmakar,M. and R. Ray Current trends in research and application of microbial cellulose. Research Journal of Microbiology,6,(1): Vllena,G. K. and Gutierrez Correa, M.2006,production of cellulose by Aspergillusnigerbofilmsdevelopd on polyester cloth. Letters in Applied Miceobiol. 43. Issue, 3: Gonsalves, K. A. and Ferreira, A.S.1993,Fusariumoxysporum. Crop Knowledge master, University of Hawii, Walter, M.; Jaklitsc, G. J.; Sarah, L.; Bing, S. L.2006,Hypocrearufa / Trichodermaviride: a ressessment, and description of five closely related species with and without warted conidia. Stud Mycol USA, 56,1: Ellis, M.B.1971,Dematianceoushypomycetes. Common wealth mycological Institute. kew, surrey, England. 608 pp. 16.Hankin, L.and Anagnostakis,S.L.1977, Solid media containing carboxy methyl cellulose to detect Cx cellulose activity of micro organisms. J. Gen Microbiol. 98: Mandels, M. and Strenbery, D.1976,Recent advances in cellulose technology. J. Ferment. Technol.54: Zaldivar, M.; Velasqez, J,C.Contreras, I. and Perez, L. M.2001,TrichodermaaureovindeT- 121, a mutant with enhanced production of lytic enzymes: Its potential use in waste cellulose degradation and/ or Biocontrol. Electron. J. Biotechnol,3: Okagbue, R. N.; Mwenje, T.; Kudange, T.; Siwela, M. and Sibanda,T. 2001,Isolation of Aureobasidiumpullulans from Zimbabwean sources and glucosidase activities of selected isolates. South African. J. Botany.67: Miller. G. L. 1959, Use of dinitrosalicylic and reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry.31: Shahera,H.A. and Sanna.M.A Biodegradation of agro-industrial orange waste under solid. 22. Bokhary, H. A. and Parrz, S.1994,Extracellulae cellulose enzyme production by soil mycoflora in Saudi Arabia. King saud Univ. vol. 6, Science. 2: Deshpande, S. K.; Bhotmange, M. G.; Chakrabarti,T. and Shastri, P. N.2008,Production of cellulose and xylanase bytrichodermareesei (QM 9414) mutant, Aspergillusnigerand mixed culture by solid state fermentation (SSF) of water hyacinth (Eichhorniacrassipes). Chen, Technol. 15: Mekala, N. K. and Singhania, R. R.2008,Cellulase production under solid state fermentation by Trichodermareesei Rut C30: statistical optimization of process parameters. Appl. Biochem. Biotechnol. 151: عبد الهادي شمال يونس تحديد كفاءة بعض العزالت الفطرية المحلية في إنتاجأنزيم السليوليز. مجلة تكريت للعلوم الصرفة. مجلد 16. العدد

12 قدرة بعض العزالت الفطرية المحلية على إنتاج أنزيم السيللوالز ود ارسة الفعالية األنزيمية علي سارة 26. Mangat, M. K. and Mandahr C. L.1998,Effect of cultural conditions on the production of cellulases by Helminthosporiumteres. Res. Bull. Punjab University Sci. 46 (1-4): Ikram- Ul- H.; Muhammad, M. J.;Tehamina, S. K. ;and Zafar, S.2005,Cotton saccharifying activity of cellulose production by co- culture of Aspergillusniger and Trichodermaviride. Agriculture waster. 11: Khan, M. M. H.;Ali, S.;Razi, A. F. and Alzam,M. Z.2007, Use of fungi for the bioconversion of rice straw into celulase enzyme. Environmental Science and Health part b.42: El- Refai, A.M.H.; Atalla, M. M. and El-Safty,H.A.1984, Microbial hormation of cellulases and proteins from cellulasic residues. Agriculture wastes,,11: الصميدعي طه عبد الوهاب تأثير فت ارت مختلفة من التحضين ومصادر كربونية مختلفة في انتاج أنزيم بيتا-كلوكوسايديس بوساطة عزلة محلية للفطر. Trichodermaharzianum مجلة تكريت للعلوم الصرفة. مجلد.13 العدد -2, Narasimha,G.; Sridevi, A.; Buddolla, V.;Subhosh, C.M. and Rajasekhar, R.B Nutrient effects on production of cellulytic enzymes by Aspergillusniger.Biotechnol. 5(5):